Protocolo de Investigación Científica

ESTUDIOS CIENTIFICOS REALIZADOS CON Basqüadé

PROTOCOLO DE TRABAJO

Ensayos cinéticos de proliferación celular
Estos ensayos se realizarán sobre dos tipos celulares:

Células tumorales: línea tumoral linfoide de origen murino BW 5147 que expresa el haplotipo H-2k, CD3+ y el TCRaß, los cuales son testeados rutinariamente por citometría de flujo usando anticuerpos específicos contra los correspondientes marcadores de superficie.
Linfocitos T normales provenientes de ganglios linfáticos de ratones de la cepa BALG/c de 3-4 meses de edad, obtenidos en forma aséptica.
Los ensayos in vitro se realizarán en condiciones de esterilidad en microplacas de cultivo de 96 wells en un volumen final de 0.2 ml.
El efecto sobre la proliferación celular de la mezcla a ensayar será evaluada a diferentes tiempos de cultivo (24, 48, 72 y 96 hs.) y en ausencia (Control) o presencia de diferentes concentraciones de mezcla a fin de determinar la cinética de acción del producto. Las concentraciones a ensayar serán diluciones seriadas al medio en un rango de concentraciones que incluye la dosis propuesta para uso en humanos (desde 1/250 hasta 1/4000).
La proliferación celular será evaluada a través de la técnica de incorporación de Timidina tritiada (20 Ci/mmol). Para ello, los cultivos celulares serán pulsados por un periodo de 16 hs en el caso de los linfocitos normales y de 6 hs para las células tumorales con Timidina tritiada, luego de lo cual los núcleos celulares son retenidos por filtración de papel de fibra de vidrio, Whatmann GF/A. La Timidina radioactiva incorporada al ADN será cuantificada en contador de centelleo líquido Wallac.

La concentración de células a utilizar será: para la línea tumoral de 3x105 células/ml (concentración celular óptima final) y para las células normales 2x106 células/ml. Ambos tipos celulares serán cultivados en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 2mM de glutamina y en presencia de los antibióticos penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml).

Curvas Dosis-Respuesta

Cinética Celular 24hs y 48hs.